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上海酶联生物PCR试剂盒实验的注意事项
发布时间:2022-06-22   点击次数:48次

上海酶联生物PCR试剂盒实验的注意事项,我司作为一家立志于为人类生命健康事业贡献力量的科研试剂研发生产型企业,产品名称依旧“不忘初心、胸怀大爱",以守护节能、健康的科研环境为己任!

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PCR实验要注意以下几点:

1. PCR引物设计:

引物设计可能是PCR扩增成功zui关键的因素。如引物设计欠佳,可能导致扩增产物不足,甚至扩增失败,其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体,此又成为PCR反应的竞争性产物,从而进一步抑制PCR产物形成。

在引物设计时必须考虑以下几个因素,其中zui重要的是引物长度、溶解温度(Tm)、特异性、引物序列互补问题、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。 

(1)引物长度:由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联,因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。

(2)溶解温度(Tm):因加热而断开H键,使双链DNA分开或“溶解"为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式计算:Tm=2(A+T) + 4(G+C)。

需注意PCR反应至少有两个(一对)引物,两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近,不可差异过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配,而引物Tm值较低,反应温度较高时则可能不能发生作用,因此如引物的Tm值差异较大,可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。

(3)引物序列互补:设计引物时应没有3个碱基以上的内引物配对,如引物有这样具有自我配对的区域,“弹回"即部分双链结构将发生在退火反应时。

(4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸:待选择的引物序列应尽可能是碱基随意分布,G+C含量平均-避免长A+T和富含G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量一般为45%-55%。在选择的引物序列中应没有多G 或多C延伸,因其可促进非特异性退火,多A 和多T延伸也应避免,因其可“呼吸"和使引物-模板复合物展开延伸,降低扩增的效率。同时多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也应被避免。 

(5)3’-末端序列:为控制引物错配,应认真地确定PCR引物中3’末端的位置。

总而言之,应重视PCR引物设计,设计PCR引物时应认真小心。对于一个成功的PCR来说,几个重要因素如引物长度、GC含量和3’序列必须优化。理想的引物应为差不多随意分布的核苷酸混合、GC含量50%、长度约为20个碱基,因此能使Tm值处于56-62oC范围。分析靶基因潜在引物位点时,应考虑无单聚合体, 没有明显的二级结构形成的倾向,不自我互补,与其他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味的设计,节省时间,减少错误,可应用计算机程序优化设计、选择、确定寡核苷酸引物。


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